Иммунофлуоресценция

Сущность метода иммунофлуоресценции заключается в визуализации реакции антигенов с антителами, которые коньюгированны с флуоресцирующим маркером. Метод конъюгации глобулинов с флуорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом.

Различают прямой, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом, и неррямой метод иммунофлуресценции, разработанный А. Кунсом и Уиллером.

При прямом методе на препарат с антигеном наносят известную, предположительно соответствующую ему, люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса, он обнаруживается посредством свечения флуорохрома, с которым конъюгированны антитела. При этом необходимо использовать для возбуждения флуоресцирующего маркера соответствующую ему длинну волны. Фильтр-системы, устанавливающиеся на пути отраженного света, позволяются специфически возбуждать интересующий маркер и получать информацию о наличии сигнала от него. 

При непрямом методе на мазок из наслоения антигена и немеченой сыворотки наносят антиглобулиновую (видовую по отношению к диагностической сыворотке) люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса антиген-антитело, последний компонент реагирует с видовой антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой. 

Результаты описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырех ++++) — субъективная градация исследователем степени выраженности реакции. Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флуорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, но требуется множество моноспецифических сывороток. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.

Метод иммунофлуоресценции на примере С.Elegans.

Зеленый: антитела к PDZ белку TAG-60. Экспрессия видна на люменальной стороне интестинальных клеток. Функция TAG-60 в период развития C. elegans изучается.

Красный: антитела к белку AJM-1, котрый экспрессируется в местах соединения эпителиальных клеток.
 

Голубой: окраска ДНК красителем DAPI.