Оборудование для микрофотосъемки. Часть 2

В прошлой статье  мы обсудили  цифровые устройства, подключаемых к микроскопам: видеоокуляры и бытовые фотоаппараты.

Цифровые камеры для микроскопии являются закономерным результатом развития электроники для съемки под микроскопом.

Цифровые камеры для подключения к микроскопам - это всегда C-mount камеры. Используя корректный адаптер ( тот, который соответствует размеру матрицы), к микроскопу можно подключить любую C-mount камеру.

Ассортимент предлагаемых на рынке камер очень велик, как  и стоимость. Все зависит решаемой задачи , что определяет  значения размера/ типа/ производителя сенсора, интерфейса передачи данных, встроенных предобработок изображения.

 

Цифровые камеры позволяют получать изображения в реальном времени, регулировать баланс белого  и снимать с наилучшим соотношением сигнал/шум.Устанавливается такая камера через стандартный c-mount адаптер микроскопа.

 

Olympus CX41 с цветной камерой Videozavr VZ-C31Sr

 

Основные характеристики камер, на которые следует обращать внимание:

1. Тип матрицы ( CCD или CMOS)
2. Разрешение
3. Скорость съемки на полном разрешении
4. Цветность (оптимально 10-12 бит)
5. Интерфейс подключения к ПК

 

1. CСD или CMOS?

 

CCD матрицы (Charge Coupled Device)

CCD матрицы (Charge Coupled Device) - сделаны на базе ПЗС датчиков (прибор с зарядовой связью). Применение CCD-матриц начинается еще с 1970-х годов, когда они широко применялись в видеокамерах и профессиональном оборудовании. Они служат для преобразования светового пучка, проходящего через объектив камеры, в электронный сигнал. Он в свою очередь преобразуется процессором камеры  в цифровой сигнал.Одним из ключевых показателей для камер является квантовая эффективность. У CCD матриц она достигает 95% ( приближается к 100% при дополнительном охлаждении до -120 0С и используется при съемке с оптических телескопов).

 

CMOS матрицы (Complementary Metal Oxide Semiconductor)

CMOS матрицы (Complementary Metal Oxide Semiconductor)  -  изготовлены на основе комплементарных металло-оксидных полупроводников. На ранних стадиях развития видеотехнологий CMOS-матрицы имели много существенных недостатков: они обладали высоким уровенем шума, остаточный заряд и большой ток утечки. По этим причинам CMOS-матрицы долгое время не использовались в профессиональной и специализированной аппаратуре. Матрицы CMOS имеют квантовую эффективность >80%.

 

 

 

 

 

 

Раньше ситуация с выбором камеры была следующая: камеры для микроскопов на базе CCD-матрицы, обеспечивали более высокие значения при съемке динамичных и небольших объектов.  Их использовали для профессиональных исследований, требующих высокого качества изображения (тёмное поле, флуоресценция). Камеры на основе CMOS-матриц  использовались для съемки неподвижных изображений в условиях высокой освещенности. Из-за дешевизны  CMOS является  бюджетным решением, когда важно было вписаться в определенную стоимость.

 

Из-за шумов CMOS  камеры давали изображения не самого лучшего качества, плохо работали в условиях низкой освещенности, в то время как CCD-матрицы показывают более низкий уровень шума, высокую контрастность и яркость изображений.

 

В исследовательской микроскопии очевидно, сколь существенна возможность качественной съемки при низкой освещенности. Освещенность было одним из ограничений к использованию CMOS-датчиков.

 

Прогресс внес свои коррективы  в порядок вещей. Новые CMOS-матрицы  имеют меньшее количество шумов и большую чувствительность, чем CCD матрицы. Примером могут послужить камеры на базе сенсоров Sony IMX-серии , например, VideoZavr Standart VZ-18C23-B.

 

2.Разрешение

Разрешение камер  подбирается под конкретное увеличение, на котором чаще всего идет съемка. Принцип "чем больше Mpix, тем лучше" при выборе камеры для микроскопа не работает. Многие современные камеры обладают разрешением, превышающим разрешение световой микроскопии. Поэтому при выборе разрешения для камеры следует ориентироваться на рабочие увеличения: если вы работаете с иммерсионным объективом 100х, лучше выбрать  камеру с меньшим разрешением (1.3-3 Мп вполне достаточно).

 

При работе с меньшими увеличениями (например, на стереомикроскопе) можно использовать 5 Мп камеры и более. Необходимо учитывать параметры освещенности объекта и выбирать сенсоры с соответствующим размером пиксела и, следовательно, уровнем чувствительности. Помните, что, чем больше размер изображения, а, тем более, кадра видеоролика, тем больше ресурсов компьютера потребуется на обработку программой и хранение на вашем носителе. Выбирайте необходимое и достаточное разрешение.

 

Чем больше разрешение у камер, тем меньше кадров в секунду  может передать камера на ПК. 5 Мпикс камера VZ-C50S дает 5 к/сек, тогда как 3.1 Мпикс камера на интерфейсе USB 2.0 дает частоту кадров 12 к/сек.

 

3. Скорость съемки на полном разрешении

 

 

Скорость передачи или отображения на экране монитора передаваемых с камеры данных является одной из важных характеристик камер. При недостаточной скорости, движения препарата на экране будут отставать от движений производимых в действительности, что напрочь может отбить желание работать глядя на монитор, и приведет к возврату к утомительной работе с  окулярами.

 

Минимальной для демонстрации "живого изображения" является скорость 12 к/сек. Для сравнения, в кинофильмах изображение дается со скоростью 25 к/сек. Для ускорения камер можно использовать биннинг.

 

Следует также обращать внимание на ПК, который используется  для работы с камерой, так как обработка изображений требует определенной вычислительной мощности компьютера. Также немаловажен интерфейс подключения, так как он также определяет скорость работы камеры. Об этом будет сказано отдельно.

 

 

4. Цветность (глубина цвета)

Каждый из миллионов пикселей на микрофотографии соответствует элементу (также называемому «пиксель», англ. «pixel») на сенсоре (сенсорная матрица) камеры. Эти элементы при попадании на них света  генерируют слабый электрический ток, измеряемый камерой и записывающийся в изображение (JPEG,TIFF,PNG).

В файл записывается информация о цвете и яркости для каждого пикселя тремя восьмиразрядными числами, по одному числу для красного, зеленого и синего каналов (эти цветовые каналы такие же, как те, что вы видите при построении цветовой гистограммы при настройке баланса белого на вашей камере).

Например, у нас есть камера с глубиной цвета 8 бит. Каждый восьмибитный канал записывает цвет по шкале 0-255 ( 2⁸=256) , предоставляя теоретический максимум в 16,777,216 оттенках (256 x 256 x 256). Человеческий глаз может различать приблизительно около 10-12 миллионов цветов, так что это число обеспечивает более чем удовлетворительное количество информации для отображения любого объекта.

Камеры для микроскопии в основном имеют цветность 10-12 бит, что более чем достаточно для качественной цветопередачи окраски исследуемого объекта.

Маска Байера

Цвет на большинстве  камер для микроскопии, и на всех камерах, представленных в нашей линейке, получается путем наложения на черно-белый сенсор разноцветных фильтров (красный, зеленый, синий), так называемой маски Байера (фильтр Байера, шаблон Байера, англ. Bayer filter - по фамилии изобретателя Брюса Байера, англ. Bryce Bayer) и последующей "дебайеризации" - интерполяции реального цвета каждого пикселя за счет использования его "соседей". Т.е. часть фотосенсоров матрицы используется для получения зеленого цвета, часть - красного, часть - синего, а затем информация пересчитывается:

G	R
B	G

Зеленых фильтров вдвое больше, чем других цветов, поскольку разрешающая способность человеческого глаза в зеленой области спектра выше. Нетрудно догадаться, что разрешающая способность черно-белой матрицы без фильтров существенно выше, поскольку значения с каждого пикселя сенсора непосредственно становится пикселем изображения, а цветная камера дает эффект "замыливания" деталей, поскольку значения пиксела изображения зависят от цвета соседей.

Эффект "замыливания"

Есть и другие способы получения цвета на камерах, например, последовательное использование фильтров одного цвета, использование нескольких матриц для фиксации нескольких цветовых каналов, но это ведет к снижению видеопотока. Чувствительность ч/б сенсора выше, чем у аналогичного цветного, поскольку цветные фильтры маски Байера на сенсоре поглощают часть света.

 

 

4. Интерфейс

При передаче качественного изображения на экран монитора узкое место - это интерфейс. При работе с интерфейсом USB 2.0 скорость будет несколько ниже,чем у USB3.0. Чтобы была понятнее разница, можно сравнить скорость 5-х мегапиксельных камер  VideoZavr с интерфейсом USB 2.0  и USB 3.0 . У камеры USB 2.0  VZ-C50S скорость на максимальном разрешении будет не выше 5 кадров в секунду, тогда как камера USB 3.0 VZ-C50S-B показывает почти в три раза большую скорость - 14 кадров в секунду.

 

На сегодняшний день самыми популярными для подключения цифровых камер для микроскопии остаются интерфейсы:

1. Firewire (IEEE 1394a)
2. USB 2.0
3. USB 3.0
4. GigE

Firewire сейчас считается морально устаревшим, однако не утратил своей актуальности. Для подключения цифровой камеры для микроскопии нужен либо разъем  IEEE 1394а либо разъем PCI Express в материнской платы ПК. Камеры  Olympus всегда поставляются с платой расширения PCIe для подключения к ПК.

 

GigE является более скоростным интерфейсом, что благоприятно отражается на скорости съемки. Подключение идет в сетевой порт ПК. Это может оказаться неудобным, если Вам также нужно будет пользоваться локальной сетью или Internet. Выходом является подключение дополнительной сетевой платы для работы с камерой для микроскопии.

 

USB 2.0 является удобным интерфейсом для подключения камеры. Для подключения необходим порт USB 2.0, имеющийся на любом ПК. Ограничением этого интерфейса является то, что при подключении нескольких устройств (флешки, USB-модем,принтер) уменьшается скорость съемки.

 

USB 3.0 новый более эффективный интерфейс, который позволяет существенно увеличить скорость и качество съемки в микроскопии. Так,  для USB 2.0 камеры Videozavr VZ-C50S  скорость съемки на полном разрешении составляет 5 к/сек,тогда как для Olympus SC50 на интерфейсе USB 3.0 составляет 15 к/сек. Для новой камеры VideoZavr VZ-C50S-B с интерфейсом USB 3.0 скорость съемки составляет 14 кадров в секунду.

Камеры с интерфейсом USB 3.0, например, камера Olympus UC90 обладает качественным «живым» изображением с  разрешением 4K и частотой кадров от 25 к/сек.

 

 

Общие рекомендации по применению камер для микроскопии

Для большинства световых микроскопов подойдут самые простые камеры как на CCD, так и CMOS матрицах.Однако, когда  речь идет о съемке в тёмном поле, люминесценции, поляризации, ДИК, задача усложняется, так как требуется очень высокая чувствительность матрицы.

При съемке в тёмном поле , например. при исследовании лептоспироза, мы видим на чёрном фоне белые быстро движущиеся нитчатые бактерии лептоспир, которые необходимо зафиксировать.Здесь необходима как высокая чувствительность матрицы, так и высокая скорость съемки, Для этого типа исследований нужно использовать  высокочувствительные камеры на базе ПЗС (CCD) матриц (VZ-CC50S, VZ-C14F).

 

Для съемки в флуоресценции (люминесценции),часто необходимо зафиксировать часто точечный сигнал флуорохрома, который быстро обесцвечивается (фотообесцвечивание).  Для качественной и быстрой фиксации  требуется высокая чувствительность матрицы. Для этого типа наблюдения подходят  монохромные камеры на CCD матрице  (VZ-M14F, VZ-41M-K).Это обеспечивает достаточное разрешение. Встроенное программное обеспечение Videozavr FISH осуществляет цветокодирование, преобразуя черно-белое изображение в то,которое мы наблюдаем в окуляры микроскопа.

 

Флуоресцентная микроскопия, методика FISH

 

При наблюдениях в поляризованном свете возникает потребность не только получить качественное изображение, но и точную цветопередачу окраски. Для этого рекомендуется использовать камеры для микроскопии на базе  CCD- матриц.  Обладая высокой чувствительностью и точной цветопередачей, изображения в поляризованном свете в точности совпадают с изображением в окулярах.

Микроскоп Olympus BX63 с цифровой камерой Olympus DP80, съемка в поляризованном свете

 

Камеры для микроскопии дают больше преимуществ по сравнению с другими вариантами съемки на микроскоп.

Вот лишь некоторые из них:

1. Работа с изображением на мониторе, а не с окулярами микроскопа.
2. Выбор оптимального разрешения камеры под Ваш рабочий диапазон увеличений.
3. Регулировка баланса белого для оптимальной цветопередачи
4. Регулируемое разрешение и скорость съемки.
5. Полный контроль камеры во время съемки.
6. Сопряжение полученных изображений и видео для дальнейших исследований (анализ спермы, морфометрия, создание виртуальных препаратов).
7. Удобное хранение полученных данных в базе данных, которая идет в комплекте с программным обеспечением.
8. Вы можете выбрать камеру с необходимой для Ваших задач чувствительностью.
9. Компактность и экономия места на рабочем месте.

Список можно продолжать и дальше, так как появляются и новые решения для съемки препаратов на микроскоп, которые расширяют функциональность этого рабочего инструмента.