Понятие флуоресценции

Флуоресценция (люминесценция)– физическое явление, заключающееся в поглощении кванта света веществом, способным флуоресцировать (флуорофором, флуорохромом), с последующим быстрым испусканем другого кванта, со свойствами, отличными от исходного. По сути явление флуоресенции представляет из себя переход электронов по энергетическим уровням вещества. Энергия, получаемая атомом вещества при облучении делится на две части. Меньшая расходуется на релаксацию, а большая уходит на излучение фотона определенной энергии. Спектр флуоресценции сдвинут относительно спектра поглощения в сторону длинных волн.

Флуоресцентные методы исследования основаны на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению.

По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ:

• цветное свечение,
• высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне,
• возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов,
• возможность исследования различных жизненных процессов в динамике их развития,
• возможность обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител.

В основе флуоресцентной микроскопии лежит способность некоторых веществ поглощать свет определенной части спектра, энергия которого затем частично выделяется в виде света. Испускаемый свет отличается от поглощенного света длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого света, и эта разность длин волн лежит в основе наблюдения флуоресценции при флуоресцентной микроскопии. Интенсивность испускаемого света меньше, чем интенсивность возбуждающего света, так как количество выделяемой энергии во много раз меньше того количества энергии, которое требуется для возбуждения.

Схематическое изображение сдвига Стокса.

Его причиной являются безызлучательные релаксационные процессы. В результате часть энергии поглощенного фотона теряется, а испускаемый фотон имеет меньшую энергию, и, соответственно, большую длину волны. Рассмотрим, каким образом испускание и поглощение света реализовано во флуоресцентном микроскопе.

Люминесцентный (люминесцентный микроскоп)

Люминесцентный микроскоп строится на базе прямого или инвертированного  микроскопа добавлением флуоресцентных модулей: осветителя отраженного света, туррели флуоресцентных фильтр-кубов, специального источника света(галогенового или металлгалидного), и, опционально, план полу апохроматическими объективами (планфлуоритами, Plan Fluorite), с расширенной спектральной пропускной характеристикой.

Флуоресцентный микроскоп обладает следующим ходом лучей. На рисунке приведена схема прямого микроскопа, в инвертированном микроскопе схема полностью аналогична, только зеркально отражена сверху вниз.

Ход лучей прямого люминесцентного микроскопа

Из спектра, испускаемого флуоресцентным источником света, вырезается полоса возбуждения необходимой ширины. (На примере это синее возбуждение, около 450 нм). Возбуждающий луч отражается от дихроичного зеркала и попадает на образец через объектив. Дихроичное зеркало отражает лучи до определенной длины волны (в данном случае до 460 нм), и пропускает лучи с большей длинной волны. В образце флуорофоры поглощают возбуждающий синий свет, и испускают более длинноволновое излучение. Флуоресцентное свечение беспрепятственно проходит через дихроичное зеркало, а барьерный фильтр отсекает нам необходимый для изучения спектр. Его необходимость заключается в том, что иногда флуоресцентное свечение находится в очень широком диапазоне длин волн, что мешает исследователю установить природу и свойства интересующего образца.

Флуоресцентный фильтр блок – устройство, объединяющее в себе дихроичное зеркало и два фильтра -возбуждения и эмиссии. Обычно в флуоресцентный микроскоп устанавливается несколько фильтров ( 3 для методики FISH), способных возбуждать флуоресценцию в различном спектре (для FISH это DAPI, FITC, Texas Red). В зависимости от флуоресцентных меток или красителей, нанесенных на образец, картина в каждом канале будет отличной. Хромосомы  будут наблюдаться в одном канале, метки  во втором и третьем. Ни один метод контрастирования не может дать такое радикальное деление образца с малым контрастом.

На рисунке изображен флуоресцентный фильтр блок (часто встречается название флуоресцентный куб) U-MWB2,  Olympus, и его спектральная характеристика. Возбуждение 460-490 нм, дихроик 500 нм и эмиссия (или барьерный фильтр) 520+ нм. Это означает, что фильтр широкополосный, и позволяет наблюдать одновременно различный окрас разных флуоресцентных меток.

Спектральные характеристики фильтров Olympus можно найти по ссылке.

Если у Вас возникнут вопросы по подбору фильтров для флуоресценции, Вы можете обратиться к нашим специалистам и они с удовольствием помогут Вам в выборе.

Для наблюдения флуоресценции абсолютно необходимо предотвратить смешение в микроскопическом изображении возбуждающего света и испускаемой флуоресценции. Качество изображения во флуоресцентной микроскопии в значительной степени определяется контрастом и яркостью изображения. Контраст изображения определяется отношением флуоресценции специфически окрашенных структур к фоновому свету. Однако оптимальный контраст может достигаться в слабых флуоресцентных изображениях благодаря, например, использованию узкополосных светофильтров, которые часто имеют небольшое пропускание. В то же время для облегчения визуальных наблюдений, для фотографирования с использованием относительно коротких выдержек и для измерений требуется сравнительно яркое изображение. Таким образом, в большинстве случаев необходимо достичь компромисса между интенсивностью специфической флуоресценции и уровнем неспецифической флуоресценции фона.