Принцип работы и устройство конфокального микроскопа

Конфокальная микроскопия представляет собой один из способов быстрого создания оптических срезов с высоким разрешением. 

Принцип конфокальной эпи-флуоресцентной лазерной сканирующей микроскопии схематично показан на рис.2.

Когерентный свет, испускаемый лазерной системой проходит через точечное отверстие (пинхол), расположенное в сопряженной фокальной плоскости и затем через второй пинхол, расположенный в  детекторе (фотоумножителе). Местоположение апертуры, оптически сопряженное с фокусом как раз отражено в термине «кон-фокальный». При этом световой лазерный луч фокусируется на небольшом участке образца. 

Лазерный луч преломляется дихроичным зеркалом и проходит вдоль образца в заданной фокальной плоскости. Вторичная флуоресценция, испускаемая из отдельных точек образца (в одинаковой фокальной плоскости), направляется к пинхолу детектора через тоже дихроичное зеркало и фокусируются как конфокальная точка.

Система устраняет свет от всех участков образца, кроме находящегося в фокальной плоскости, поэтому при сканировании вдоль осей X и Y
получается оптический срез сфокусированного участка без применения программно-реализованных алгоритмов.

Подавляющее большинство флуоресцентных сигналов от образца, которые возникают в точках над и под фокальной плоскостью не находятся в одной фокальной плоскости с пинхолом (так называемые внефокусные лучи) и формируют обширные диски Эйри в плоскости апертуры.

Т.к. только малая часть внефокусного света проходит через пинхол, большинство постороннего света не улавливается чуствительным фотоумножителем и не влияет на результирующее изображение. Дихроичное зеркало, барьерный фильтр и возбуждающий фильтр выполняют сходную функцию в широкопольной эпи-флуоресцентной микроскопии. Изменение фокусировки обектива в конфокальном микроскопе сдвигает  точки возбуждения и испускания в препарате в новую плоскость, которая становится конфокальной с пинхолом источника света и детектора. 

В традиционной широкопольной флуоресцентной микроскопии весь препарат подвергается интенсивному освещению от таких источников света как ртутная или ксеноновая лампа, и полученное изображение имиссии мы можем визуализировать через окуляры или имиджинговые системы. В оличии от этого простого принципа, механизм получения изображения в конфокальном микроскопе фундаментально иной. Как обсуждалось ранее конфокальная микроскопия состоит из множественных источников освещения на основе лазера, сканера с оптическими и электронными компонентами, электронного детектора (обычно фотоумножителя) и компьютера для обработки, анализа изображения и вывода его на экран.

По материалам ресурсного центра Olympus www.olympusmicro.com