Настройка системы освещения по Келеру

Вся современная микроскопия, с помощью которой исследователи стремятся понять, как соотносится получаемое в микроскопе изображение с физико-химической природой препарата, начинается с освещения по Кёлеру.
Система освещения в микроскопе служит для того, чтобы, во-первых, получить равномерно освещенное поле зрения, на котором детали образца могут быть хорошо различимы, и, во-вторых, осветить образец как можно более широким пучком света с целью достичь максимального разрешения мелких деталей.

Принципы метода

• Линза, находящаяся впереди источника света, формирует изображение источника света не в плоскости препарата.
• Вторая линза (конденсор) переносит изображение поверхности первой линзы на исследуемый образец. Она имеет минимальное фокусное расстояние, чем достигается максимальный раствор конуса света, падающего на образец.

Фирмы — изготовители микроскопов прилагают подробную инструкцию к каждому типу выпускаемого микроскопа, но в лабораториях описания часто теряются или в них не считают нужным заглядывать.

Подготовка к настройке освещения

1. Проверьте, что ваш микроскоп имеет коллекторную линзу, которая находится между лампой и конденсором. Эта линза может быть встроена в основание микроскопа, но и в данном случае она устанавливается для того, чтобы проецировать изображение источника света на ирисовую диафрагму конденсора. Когда диафрагма закрыта, при помощи зеркала можно увидеть, так ли это в действительности. Во многих случаях, однако, нить лампы бывает не видна из-за того, что мешает матовое стекло. В таких случаях необходимо просто полностью осветить ирисовую диафрагму конденсора. В некоторых типах микроскопов для этого нет котировочных приспособлений, но принцип остается прежним. Могут иметься винты, центрирующие нить лампы относительно коллекторной линзы. На коллекторной линзе может находиться ирисовая диафрагма, которая называется диафрагмой поля зрения.

2. Проверьте наличие в микроскопе конденсора и его диафрагмы. В хороших системах диафрагма находится в передней фокальной плоскости конденсора. Она называется апертурной диафрагмой.
Конденсор может иметь дополнительные приспособления для настройки. В конденсоре с верхней откидной линзой последняя может перемещением рукоятки вводиться или выводиться из хода лучей. В конденсоре альтернативной конструкции имеется нижняя дополнительная линза, которая может вводиться или выводиться из хода лучей. Верхняя откидная линза, будучи введена в ход лучей, уменьшает фокусное расстояние конденсора, в то время как дополнительная нижняя линза во втором случае, если она находится в ходе лучей, увеличивает фокусное расстояние конденсора. Эти переключения влияют на размер изображения апертурной диафрагмы в плоскости препарата. Обратите внимание на возможности центровки конденсора, а также его диафрагмы.

3. Окуляр можно вынуть и заменить на вспомогательный микроскоп (фазовый телескоп), который может быть сфокусирован на заднюю поверхность объектива, или, более точно, на заднюю фокальную плоскость объектива. Некоторые микроскопы имеют сменные окуляры с вращающейся вспомогательной линзой, которая превращает окуляр в фазовый телескоп. В такой системе также должна быть возможность фокусировки. Проверьте это на вашем микроскопе.

 Установка света по Кёлеру.

1. Включите свет и отцентрируйте его, следуя инструкции фирмы-изготовителя.

2. Взяв контрастный препарат, содержащий окрашенные компоненты, сфокусируйте его, используя объектив Х10.

3. Глядя в окуляры, постепенно закрывайте полевую диафрагму до тех пор, пока она не станет видна в плоскости образца. Она может быть/не быть четко сфокусирована и может быть/не быть в центре поля зрения.

4. Сфокусируйте как следует изображение полевой диафрагмы, перемещая конденсор вверх или вниз. Обратите внимание, что в процессе фокусировки по краю диафрагмы появится желтая или синяя кайма. Если оба цвета присутствуют вокруг края одновременно, то это следствие плохой юстировки, которую нужно тогда произвести заново.

5. Отцентрируйте изображение полевой диафрагмы. В большинстве случаев для этого используются центровочные винты конденсора. Для проверки центровки раскрывайте полевую диафрагму до тех пор, пока ее граница не приблизится вплотную к краю поля зрения.

6. Откройте полевую диафрагму так, чтобы ее граница была вне поля зрения. Именно на этом этапе обнаруживается, что для объективов с малым увеличением изображение полевой диафрагмы недостаточно велико, чтобы заполнить все поле зрения. В этом случае следует либо откинуть верхнюю линзу, либо ввести добавочную нижнюю линзу. После этого конденсор должен быть вновь сфокусирован, как указано выше.

7. Выньте окуляр, вставьте фазовый телескоп (или переключите сменную окулярную линзу) и сфокусируйте его на заднюю фокальную плоскость (з. ф. п.) объектива. В том, что фокус наведен, можно убедиться, увидев в поле зрения диафрагму конденсора. Чтобы удостовериться в этом, откройте и закройте диафрагму конденсора. Микроскоп может быть снабжен приспособлением для ее центровки по отношению к з. ф. п. объектива. Если оно есть, то проделайте эту операцию (будьте осторожны, чтобы не нарушить центровочными винтами положение конденсора, которое вы уже установили).
Установите такой размер апертурной диафрагмы, чтобы ее изображение занимало около 70% з. ф. п. объектива. Вы увидите, что блики с боковых поверхностей тубуса микроскопа исчезают по мере того, как вы производите юстировку.
Вы можете также заметить изображение нити лампы в центре ярко освещенного пятна. Это правильно. Если есть возможность центрировать апертурную диафрагму, отцентрируйте ее по отношению к объективу и затем, используя центровочные винты лампы, отцентрируйте в свою очередь и ее. Наличие матового стекла приведет к тому, что это изображение будет нечетким, так что центрировать придется по максимальной яркости.

8. Вставьте окуляр и убедитесь, что вы достигли наилучшей ситуации для данных положений объектива и конденсора. При излишней яркости освещенность нельзя уменьшать, регулируя размер освещенной апертуры. Регулировка интенсивности освещения детально рассмотрена на этапе 10.

9. При смене объектива проверьте этапы 3—6. Вы увидите, что некоторая юстировка нужна на этапе 6 и минимальная— на остальных этапах. Затем пройдите этап 7, где необходимо существенно изменить размер освещенного пятна апертурной диафрагмы, для того чтобы она соответствовала числовой апертуре (NA) нового объектива.

10. При визуальной микроскопии яркость изображения может регулироваться изменением напряжения на лампе. Однако снижение напряжения приведет к преобладанию в спектре теплых тонов из-за увеличения красной и уменьшения синей составляющих. Этот метод непригоден для целей фотографии. Как при визуальной микроскопии, так и при фотомикрографии интенсивность света может быть ослаблена с помощью нейтральных серых светофильтров, которые устанавливаются перед конденсором.