Модуляционный (рельефный) контраст Хоффмана

Система модуляционного контраста Хоффмана была призвана улучшить видимость и контраст при исследовании неокрашенных и живых материалов путем детектирования оптических градиентов (или углов) и преобразовывания их в вариации интенсивности яркости. Эта техника была открыта Доктором Робертом Хоффманом в 1975. Применяется контраст Хоффмана в исследованиях на инвертированных микроскопах.

Стандартная конфигурация микроскопа для Хоффмановского модуляционного контраста проиллюстрирована на рисунке 1.

Объемный фильтр, названный Хоффманом «модулятором», вставляется в заднюю фокальную плоскость ахроматического или планахроматического объектива (хотя может быть использован объектив с большей коррекцией).

Интенсивность света проходящая сквозь систему варьируется выше и ниже среднего значения, потому и названа термином «модулируется».

Объективы микроскопа подходящие для модуляционного контраста охватывают всю область увеличений: от 10х до 100х. Модулятор имеет три зоны, как изображено на рис. 2: малая, темная область возле периферии задней фокальной плоскости, которая пропускает только 1% света (область отмечена “D” на рис. 2); узкая серая область, которая пропускает 15% (область отмечена  "G" на рис. 2); и оставшаяся прозрачная область, покрывающая почти всю площадь  з.ф.п., которая пропускает 100% лучей (область отмечена “B” на рис. 2).

В отличие от фазовой пластинки в фазово-контрастной микроскопии, Хоффмановский модулятор не призван изменять фазу света, проходящего через любую из областей.

Объекты, которые, почти невидимы в светлопольной микроскопии, принимают отчетливые объемные очертания, при использовании модуляционного контраста, что  обусловлено различными показателями преломления в разных фазах объекта.

Модулятор не вносит фазовых изменений для света, проходящего через разные части модулятора, но влияет на главный порядок нулевого максимума. Диффракционные максимумы более высоких порядков остаются без изменений.

Измерения, с использованием интерферометра Михельсона подтвердили, что фазовые различия света, прошедшего через модулятор Хоффмана не превышают (если имеются) значений, кратных λ/20.

Ниже образца располагается конденсор микроскопа с вращающейся туррелью, предназначенной для оставшихся компонентов системы Хоффмановского модуляционного контраста.

На каждой позиции туррели имеется щель, находящаяся вне центра, которая частично закрыта маленьким прямоугольным поляризатором.

Комбинация соотношения размера щели/поляризатора различна для каждого объектива в зависимости от увеличения, поэтому и требуется туррельный механизм.

Изображения, получаемые при использовании модуляционного контраста Хоффмана, оттеняются и являются псевдотрехмерными, с улучшенной видимостью из-за разницы в контрасте на каждой стороне детали. Здесь нет гало эффекта, в отличие от изображений, сделанных на фазово-контрастной оптике. Следует отметить, что интерпретация изображений не всегда является интуитивной, поскольку элементы образца, которые выглядят как впадины или возвышения, могут быть просто участками с разными показателями преломления.

Образец изображения в рельефном контрасте. Эмбрион млекопитающего. Olympus IX 53

Хотелось бы отметить, что двулучепреломляющие объекты (кристаллы, костная ткань, тонкие слои горных пород и т.д.), которые могут вводить в заблуждение при использовании ДИК, могут быть с успехом исследованы с использованием модуляционного контраста, посколько образец не расположен между двумя поляризаторами.

Помимо этого, образцы могут находится как в пластиковых, так и в стеклянных емкостях, без ухудшения изображения из-за поляризационных эффектов (при прохождении через анизатропные среды). Это делает метод с использованием модуляционного контраста Хоффмана намного более полезным, нежели ДИК контраст при изучении или документировании клеток, тканей в пластиковых контейнерах.

Методика для изучения образца с использованием модуляционного контраста Хоффмана.

• Установите подходящие объективы для рельефного контраста в револьверные гнезда микроскопа и установите конденсор с туррелью, содержащий соответствующие щелевые пластины.
• Если микроскоп оснащен для ДИК или поляризационной микроскопии, уберите все поляризаторы, призмы Волластона и другие поляризующие оптические элементы со светого пути.
• Поместите окрашенный образец в препаратодержатель и настройте освещение по Келеру. Модуляционная щелевая пластина должна быть вынута из конденсора в это время, либо он должен быть выставлен на позицию для светлого поля.
• Наблюдайти пластинку подулятора в з.ф.п. объектива, используя линзу Бертрана, фазовый телесокп, или просто вынув окуляр и заглянув вниз окулярной трубки. Убедитесь, что образец вынут со светового пути или смещен на прозрачную область.
• Настройте апертурную диафрагму, которая соответствует 10х объективу
• Поместите круглый поляризующий фильтр на осветитель ниже конденсора. Поворачивая  фильтр и одновременно наблюдая изображение щели через линзу Бертрана или фазовый телескоп, вы заметите, что угол поворота влияет на количество света, проходящего через ту часть щели, где имеется поляризующая пластинка.
• Переместите изображение щели, чтобы открытая (без поляризатора) часть зашла на серую область модулятора как показано на рис. 3 (b). Та, часть щели, которая содержит поляризующий материал должна располагаться на прозрачной области модулятора, сразу рядом с серой областью.  Поворачивая круглый поляризующий фильтр, наблюдайте, как та область щели, которая содержит поляризатор появляется и исчезает. Когда плоскость поляризации в круглом поляризаторе оказывается перпендикулярной плоскости поляризации щелевого поляризатора, достигается максимальный контраст
• Выньте линзу Бертрана или фазовый телескоп и верните окуляр на прежнее место.
• Установите образец и сфокусируйтесь на нем с помощью 10х объектива.
• Отрегулируйте положение конденсора, заново сфокусировавшись на полевой диафрагме. Откройте полевую диафрагму.
• Изображение готово для изучения или документирования с использованием модуляционного контраста. Поворачивайте образец и/или круглый поляризатор для достижения оптимального контраста. Эти настройки зависят сугубо от конкретного образца.
• Повторяйте вышеприведенные шаги каждый раз при изменении выбранного увеличения при наблюдении с использованием модуляционного контраста.

Материал подготовлен по материалам, предоставленным информационно-ресурным сайтом фирмы Olympus: www.olympusmicro.com